腺病毒（Human adenoviruses，HAdVs) 是人呼吸道感染常見的病原體之一，可引起廣泛的臨床疾病，包括肺炎、支氣管炎、膀胱炎、眼結(jié)膜炎、胃腸道疾病及腦炎等，在兒童及免疫功能缺陷患者中癥狀尤其嚴(yán)重。HAdVs基因型別眾多，且不同型別間或同一型別內(nèi)均可發(fā)生重組，導(dǎo)致新的毒株產(chǎn)生，對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生極大的影響。傳統(tǒng)對(duì)HAdVs的診斷及分型主要依賴病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)及關(guān)鍵衣殼蛋白（capsid）基因的PCR鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)中和抗體等試劑依賴程度很高。基于mNGS的病原微生物診斷，可以直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，而不依賴微生物的分離和培養(yǎng)，能夠快速、客觀地檢測(cè)臨床樣本中所有未知的病原微生物，已成為感染性疾病精準(zhǔn)診斷的重要工具。此外，通過對(duì)mNGS序列進(jìn)行病原體基因組組裝，可以在基因組和基因?qū)用鎸?duì)病原體進(jìn)行深入的探究。

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研究框架

本研究于2018~2019年，在湖北省咸寧市某醫(yī)院收集400例流感樣上呼吸道感染患者的鼻咽拭子樣本，對(duì)常見呼吸道病毒病原體進(jìn)行篩查后，確定21例HAdVs陽性患者，共獲得25份樣本（包含4例病毒分離培養(yǎng)樣本）。隨后，將這25個(gè)樣本分別使用GenoLab M及NextSeq 550平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序和相關(guān)分析。

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mNGS組裝完整性及準(zhǔn)確性評(píng)估

本研究首先對(duì)所有下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，確定GenoLab M及NextSeq 550平臺(tái)均可獲得可靠的mNGS測(cè)序數(shù)據(jù)。隨后對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行de novo組裝，并評(píng)估了組裝的完整度及準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：①在組裝完整性方面（指標(biāo)：contig數(shù)量, N50, N90, 最大contig長度，覆蓋度），兩平臺(tái)基本一致；②在組裝準(zhǔn)確性方面（指標(biāo)：組裝的基因組與參考基因組的比對(duì)率），GenoLab M平臺(tái)88% (22/25)的樣本，NextSeq 550平臺(tái)84% (21/25)的樣本，獲得了＞90%的比對(duì)率。說明兩平臺(tái)組裝的基因組準(zhǔn)確性均較高，可以進(jìn)行后續(xù)基因組特征的分析。

Table1 GenoLab M與NextSeq 550組裝參數(shù)表

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平臺(tái)間mNGS物種注釋結(jié)果比較

研究人員對(duì)兩個(gè)平臺(tái)的mNGS數(shù)據(jù)進(jìn)行了物種注釋，發(fā)現(xiàn)檢出的微生物種類及豐度高度一致，且HAdVs含量豐富。臨床樣本相對(duì)病毒分離培養(yǎng)的樣本，檢出的微生物種類更為復(fù)雜。SE75（圖1B）模擬測(cè)序與SE150（圖1A）測(cè)序獲得一致的物種注釋結(jié)果，說明在基于mNGS的HAdVs感染診斷中，測(cè)序時(shí)間更短的SE75模式同樣適用，可以實(shí)現(xiàn)更快速的病原體診斷。

圖1 mNGS物種注釋結(jié)果比較

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HAdVs基因型分類及進(jìn)化樹分析

該研究對(duì)25個(gè)測(cè)序樣本進(jìn)行了HAdVs分型，共鑒定得到7種HAdVs基因型：HAdV-B3 (n=9)，B7 (n=1)，B55 (n=2)；HAdV-C1 (n=2)，C2 (n=6)，C5 (n=1)；以及HAdV-E4 (n=4)。結(jié)果表明，在湖北咸寧地區(qū)，HAdV基因型多樣性較高，且以B3, C2和E4為主。不同的基因型聚類為不同的進(jìn)化分支，同一基因型的不同分離株聚類為同一分支。

圖2 HAdVs基因型分類及進(jìn)化樹分析

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不同基因型的全基因組進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步探討不同型別的分離株與已發(fā)現(xiàn)的參考毒株的進(jìn)化關(guān)系，研究人員對(duì)HAdV-B，C，E毒株分別進(jìn)行了全基因組進(jìn)化分析。結(jié)果表明：①新鑒定的分離株與對(duì)應(yīng)的參考毒株形成預(yù)期的聚類，且與當(dāng)?shù)貜V泛流傳的毒株進(jìn)化關(guān)系密切；②B3基因型已開始形成新的聚類分支，需加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)；③S64、S71和S28分離株經(jīng)重組及全基因組比對(duì)分析，確定為重組毒株。

圖3?不同基因型全基因組進(jìn)化樹分析

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核苷酸一致性和多樣性分析

全基因組核苷酸一致性分析表明，HAdVs不同型別間具有較高的進(jìn)化保守性，HAdV-B, C和E基因組一致性分別達(dá)到93.52%，97.49%和96.99%。三個(gè)關(guān)鍵capsid基因——penton，hexon和fiber的多樣性分析表明：penton基因在HAdV-C中更為保守，在HAdV-B中多樣性很高，且存在兩個(gè)明顯的高變區(qū)；hexon基因在HAdV-B和C中多樣性更高，同樣存在兩個(gè)高變區(qū)，形成中和抗體識(shí)別的表位；fiber基因在三種基因型中，多樣性都很高，其C端的γ表位參與血凝抑制，決定病毒的組織偏好性（嗜性）。

圖4?病毒全基因組及關(guān)鍵capsid基因核苷酸一致性及多樣性分析